Mesure et interprétation des microstructures d’otolithes de poisson

Introduction

Un examen type de la microstructure d'un otolithe préparé révèle de nombreuses structures concentriques, dont seule une fraction représente des accroissements journaliers. Bien que l'interprétation de ces accroissements repose sur des bases plus solides que ce n'était le cas il y a six ans, il reste une part de subjectivité indéniable et importante qui a été mise en évidence dans une étude récente. En effet, un grand nombre de larves de hareng ( Clupea harengus) de divers âges connus, prélevées dans un mésocosme, ont été distribuées, aux fins de détermination de l'âge, à des lecteurs d'otolithe chevronnés de 12 pays différents (Campana et Moksness 1991), qui ignoraient complètement l'âge des larves et la fréquence d'échantillonnage. Ils ont en moyenne précisément estimé les différences d'âge entre les échantillons, mais les écarts entre les lecteurs étaient importants (et parfois très marqués). La plupart ont été imputés à des différences de formation, de technique utilisée et d'interprétation des accroissements. Une conclusion importante de l'étude montre que certaines pratiques, tant sur le plan des techniques que de l'interprétation, sont meilleures que d'autres et qu'un protocole normalisé permettrait d'accroître l'exactitude et la précision de la lecture des otolithes et la cohérence des résultats entre lecteurs. Sont présentées dans les lignes qui suivent quelques recommandations au sujet de l'interprétation des microstructures d'otolithes afin d'atteindre cet objectif.

Seront décrites dans les sections suivantes plusieurs procédures qui contribueront à interpréter et quantifier avec succès les microstructures d'otolithes. Bien que la plupart d'entre elles reposent sur un fondement théorique, elles ont été étayées par de solides observations empiriques. L'accent est mis sur la microscopie optique, étant donné que c'est l'instrument le plus communément utilisé pour examiner les microstructures d'otolithes. Pour des raisons similaires, la discussion des techniques de quantification porte principalement sur le dénombrement et la mesure des accroissements journaliers. D'autres types de mesure, comme les analyses isotopiques, ne sont en revanche pas traités. Voir Neilson (dans la publication citée en haut de la page) pour d'autres renseignements sur les sources d'erreur dans l'examen d'otolithes au microscope optique et l'interprétation des accroissements d'otolithes.

Dénombrement des accroissements

Les concepts reconnus à l'heure actuelle sur la formation d'accroissements journaliers estiment qu'ils sont formés en réponse à un rythme circadien endogène (Mugiya et al. 1981; Campana et Neilson 1985). Il existe certes une possibilité de masquage environnemental imputable à des variables comme la température et l'alimentation, mais ces signaux environnementaux ont tendance à produire des accroissements qui s'ajoutent à ceux produits en réponse au rythme endogène. On peut donc s'attendre à ce que les microstructures d'otolithes se manifestent comme une séquence d'accroissements journaliers déposés à intervalles réguliers, recouverts ou séparés à l'occasion par des accroissements subjournaliers d'origine environnementale. Prenons comme analogie un patron de vagues formées à intervalles réguliers à la surface de l'océan (rythme circadien endogène), recouvert de vagues et de rides résultant du passage de bateaux (signaux environnementaux). Naturellement, la phase et l'amplitude des vagues causées par les bateaux varieront selon la taille et le moment du passage de ces derniers, ce qui produira des vagues soit plus petites ou plus grosses que les vagues de l'océan. En outre, les phases et les longueurs d'onde apparemment aléatoires des vagues des bateaux peuvent amplifier ou neutraliser les vagues de l'océan ou s'intercaler entre elles, produisant un patron de vagues général qui peut sembler régulier ou non. Les accroissements subjournaliers forment un patron semblable, du fait qu'ils peuvent être d'intensités, de largeurs et de phases variables à l'intérieur d'un accroissement journalier. Cependant, le patron sous-jacent des accroissements journaliers est habituellement uni et régulier. Ces observations, qui se conforment avec le fondement conceptuel sous-jacent de la formation des accroissements, simplifient l'interprétation des otolithes jamais examinés étant donné que les patrons de croissance microstructurale semblent être identiques pour toutes les espèces (Campana et Neilson 1985; Jones 1986).

Choix de l'axe de dénombrement

FIG. 1. Choix d'un axe de dénombrement des accroissements (trait continu) dans un lapillus poli de morue juvénile. La trajectoire commence à la discontinuité d'éclosion et se prolonge dans la partie distale jusqu'à une discontinuité servant de point de repère lorsqu'on change d'axe de dénombrement. Plusieurs axes de dénombrement, évitant tous une grande région d'accroissements confluents (C) et une seconde région d'accroissements peu clairs (U), sont possibles. Échelle = 20 µm.

Il faut, avant de commencer l'examen, choisir une trajectoire ou un axe de dénombrement approprié. Pour ce faire, deux critères doivent être pris en compte : la longueur de l'axe et la netteté des accroissements. La longueur de l'axe est un facteur clé, étant donné que les radii d'un otolithe ne montrent pas tous une séquence complète d'accroissements, en particulier le long des axes les plus courts (fig. 1). La présence de discontinuités et/ou d'accroissements journaliers confluents est révélatrice de secteurs contenant des séquences incomplètes, qu'il faut prendre soin d'éviter. En théorie, il serait préférable de choisir l'axe le plus long, mais c'est le long de ce dernier que l'on retrouve le plus souvent des accroissements pouvant prêter à confusion. Un bon compromis consiste à choisir le radius le plus court montrant une séquence complète d'accroissements (fig. 1). L'axe de dénombrement peut alors être choisi en fonction du deuxième critère, soit la netteté des accroissements. Il est normal que celle-ci varie le long de l'axe de dénombrement, que ce soit à cause d'un manque de cohérence dans la préparation des otolithes ou de facteurs non contrôlables liés à leur croissance. Étant donné que les accroissements ne doivent pas nécessairement être dénombrés le long d'une ligne droite, il est souvent utile de changer d'axe afin d'éviter les secteurs où ils sont ambigus ou peu clairs. Il va de soi que la séquence des accroissements ne doit jamais être interrompue. En cas d'examen au microscope optique, il est préférable de commencer par définir mentalement les axes de dénombrement en utilisant des grossissements inférieurs à ceux qui seront nécessaires pour dénombrer les accroissements.

Optimisation des images

Les caractéristiques microstructurales de la plupart des otolithes étant minuscules, des améliorations même ténues de la technique d'observation pourront se révéler précieuses. La préparation soignée de l'échantillon, en particulier lors du polissage, est généralement le meilleur moyen d'accroître la visibilité d'une séquence d'accroissements (voir Secor et al., dans la publication citée en haut de la page). Cependant, on ne saurait trop insister sur l'importance de techniques de microscopie adéquates et, plus récemment, des systèmes d'analyse d'image. L'accent sera mis ici sur l'optimisation d'images obtenues avec un microscope optique, puisque c'est l'instrument d'examen des microstructures le plus courant. En revanche, il ne sera pas question de l'optimisation des images obtenues avec un microscope électronique à balayage, qui est expliquée dans la plupart des guides d'utilisation de ce type de microscope.

Pour examiner les caractéristiques microstructurales d'otolithes, il est recommandé d'utiliser un microscope composé muni des éléments suivants (au minimum) : des oculaires jumelés, dont au moins un peut être réglé, des lentilles d'objectif à grossissement nominal de 16, 40 et 100x, dont au moins une est à immersion, une platine mobile, un condenseur de platine, un diaphragme d'ouverture et un illuminateur d'intensité variable muni de sa propre lentille de condensation/de focalisation. L'utilisation d'un microscope de moindre qualité causera, au mieux, une fatigue oculaire chez le lecteur et, au pire, de considérables erreurs dans le dénombrement des accroissements. Le risque le plus grave que pose l'utilisation d'un microscope dont les dispositifs optiques sont inadéquats ou mal centrés est l'incapacité à constater la présence d'accroissements étroits (< 1 µm de largeur), qu'on trouve notamment chez les poissons des eaux tempérées dont les larves sont pélagiques (Campana et al. 1987; Jones et Brothers 1987) et les poissons subadultes et adultes.

La qualité générale de l'image et, particulièrement, sa résolution peuvent être autant tributaires des techniques de microscopie que du matériel utilisé. Pour cette raison, et étant donné la sensibilité de nombreuses interprétations d'otolithes à la qualité de l'image, une discussion des facteurs qui agissent sur la résolution est justifiée. Dans le présent contexte, la limite de résolution est définie comme la distance minimale sous laquelle deux structures contiguës ne sont plus distinguées. Pour une discussion plus exhaustive des principes et des techniques de microscopie, voir l'un des nombreux excellents textes sur le sujet (p. ex., Eastman Kodak Co. 1980).

Caractéristiques des limites d'un microscope composé, en fonction des principaux types de lentilles d'objectifs.

L'objectif est probablement l'élément qui agit le plus sur la résolution. Des trois principaux types de lentilles, la lentille achromatique est la plus populaire et la moins coûteuse. Cette lentille corrige en partie l'aberration chromatique et sphérique et possède une ouverture numérique (O.N.) qui, bien que faible, est utilisable. (Le type de lentille, le grossissement de l'objectif et l'O.N. sont toujours gravés sur le tube de l'objectif.) Les utilisateurs d'une lentille achromatique remarqueront souvent que l'image semble meilleure lorsque le diaphragme d'ouverture est fermé et qu'une lumière d'une seule couleur (p. ex., lumière verte) est utilisée. Ce changement dans la qualité de l'image peut être attribué au fait que la lentille n'est pas entièrement corrigée pour toutes les longueurs d'onde de la lumière ou pour l'ensemble du champ de vision. La correction des aberrations est meilleure dans le cas d'une lentille semi-apochromatique, généralement faite de fluorine, et elle est presque totale avec une lentille apochromatique. Les meilleures qualité d'image et résolution sont obtenues avec cette dernière (tableau 1), mais les trois types de lentille conviennent pour les examens courants des microstructures d'otolithes. Toutes ces lentilles peuvent être achetées sous forme d'objectifs plans (p. ex., planachromatique), qui donnent une meilleure image aux limites du champ de vision.

L'ouverture numérique (O.N.) de l'objectif détermine en fin de compte le grossissement et la résolution obtenus. La résolution (R) augmente avec l'O.N., comme dans l'équation suivante :

où lambda est la longueur d'onde de la lumière utilisée. On obtient donc la résolution la plus élevée avec des objectifs ayant la plus grande O.N. (tableau 1). On doit toutefois noter que l'indice de réfraction de tous les milieux entre le condenseur et l'objectif, ainsi que l'O.N. de la lentille de l'objectif, limitent l'O.N. du microscope. La présence d'air le long de la raie spectrale limite l'O.N. effective à 1,0, quelle que soit l'O.N. de l'objectif utilisé. On doit donc utiliser un objectif à immersion pour obtenir une O.N. > 1,0. Ce que la plupart des microscopistes ne savent pas, c'est qu'ils doivent aussi utiliser de l'huile d'immersion entre le condenseur et la lame pour obtenir une O.N. > 1,0. Il semblerait que parmi ceux qui observent les microstructures d'otolithes, peu soient conscients de cette contrainte, ce qui restreint la limite de résolution utile d'un microscope optique parfaitement centré à presque 0,27 pm (tableau 1). L'installation d'un filtre bleu sur la source lumineuse peut accroître cette limite de 15 à 20 %.

Bien que la résolution ait une limite bien définie en microscopie optique, on peut augmenter le grossissement presque sans fin. Il est donc assez facile de monter un microscope avec un objectif de 100x, des oculaires de 25x et un tube de 2x pour obtenir un grossissement de 5000x. Cependant, la plus grande partie du grossissement est « vide », c'est-à-dire que l'image est grande, mais ne montre pas plus de détails que ceux visibles à environ 1250x. Le grossissement maximum utile de la plupart des microscopes se situe entre 1000 et 1250x (tableau 1).

En plus de l'objectif, une source lumineuse optimisée aura la plus forte incidence sur la qualité de l'image. L'éclairage de Köhler est le moyen le plus commun de le faire; il permet d'éclairer tout l'échantillon vivement et uniformément afin d'obtenir une profondeur de champ adéquate et une résolution élevée. Les étapes du réglage de l'éclairage de Köhler, qui sont discutées dans un autre document (Eastman Kodak Co. 1980), tournent autour du centrage de la source lumineuse dans l'image, la focalisation de la lumière sur le plan de la platine (en focalisant le condenseur) et le réglage du diaphragme d'ouverture. Un condenseur bien focalisé se situe généralement près de la limite supérieure du déplacement de la platine. Une fois en place sur un microscope donné, peu d'autres réglages seront requis lorsque le spécimen ou le grossissement sera changé. Bien qu'il soit souvent utilisé (à tort) pour compenser des changements d'éclairement, un diaphragme d'ouverture adéquatement réglé équilibrera le contraste, la profondeur de champ et la résolution.

Une fois les parties optiques du microscope alignées et optimisées, le lecteur d'otolithes doit choisir le grossissement qu'il utilisera pour examiner l'échantillon. Il cherchera à trouver un juste milieu entre la clarté apparente de la séquence d'accroissements et la facilité à les dénombrer. Les accroissements journaliers sont invariablement plus faciles à voir à de faibles grossissements, en partie parce les artéfacts et les accroissements subjournaliers (et tout accroissement journalier étroit) sont moins perceptibles. À part la résolution réduite des accroissements voisins, il est intrinsèquement difficile de dénombrer des séquences d'accroissements journaliers à un grossissement faible, car nos yeux ont tendance à se promener involontairement lorsqu'un grand nombre de structures d'apparence semblable sont visibles dans un même champ de vision. À l'extrême opposé, l'examen à un grossissement élevé d'accroissements larges peut être déconcertant, car la structure interne des zones discontinues et des zones de croissance peut être étonnamment complexe. Généralement, en pratique, un grossissement de 400x convient souvent pour examiner des otolithes à croissance rapide, alors que des grossissements de 1000 à 1250x seront requis lorsque la largeur des accroissements est inférieure à 1 à 2 µm. Dans les deux cas, un champ de vision où environ 20 accroissements sont visibles simultanément est un critère pertinent. Heureusement, l'utilisation d'huile d'immersion avec des objectifs à fort grossissement (plus de 40x) a tendance à égaliser l'image en obscurcissant les imperfections superficielles de l'échantillon.

Bien que ce ne soit pas nécessairement utile dans d'autres applications de la microscopie, un réglage fréquent de la mise au point pendant le balayage et/ou le dénombrement des accroissements est presque obligatoire. Ceci permet non seulement de distinguer plus facilement les accroissements journaliers et subjournaliers, mais aussi de compenser les variations intrinsèques du plan focal des accroissements mêmes. Ces variations, qu'elles soient dues à des erreurs d'alignement pendant le montage ou à la croissance non plane des otolithes, expliquent les difficultés et les erreurs que de nombreux lecteurs d'otolithes connaissent lorsqu'ils dénombrent les accroissements journaliers sur des photographies. En outre, la profondeur de champ des photographies est très faible (tableau 1). C'est pourquoi il est généralement préférable de dénombrer les accroissements par examen direct au microscope plutôt que sur des photomicrographies.

Systèmes d'analyse d'image

FIG. 2. Expansion de la dynamique des niveaux de gris (à droite), par un système d'analyse d'image, d'une image peu contrastée prise au microscope optique (à gauche) d'une séquence de croissance d'otolithe, photographiée directement à partir du moniteur vidéo. Les deux photographies ont été prises, développées et imprimées dans des conditions identiques. La préparation de l'image vidéo accentuée a pris environ 2 secondes. Bien que l'expansion de la dynamique des niveaux de gris soit un moyen efficace d'améliorer le contraste, d'autres procédés d'analyse d'image permettent aussi de rendre une image plus nette ou de la filtrer.

Tous ceux travaillant avec des préparations d'otolithes savent qu'un système d'analyse d'image peut être un outil puissant et un allié précieux. C'est pourquoi nous présenterons ici une brève description des capacités et des applications de l'analyse d'image. L'analyse d'image est un terme générique désignant la numérisation et la manipulation d'images visuelles. Sous sa forme la plus simple, un système d'analyse d'image peut mémoriser une image et la restituer, intacte, à la demande. En pratique, toutefois, les images mémorisées dans un système d'analyse d'image sont accentuées et/ou quantifiées avant d'être réaffichées, c'est là que réside leur avantage sur l'examen visuel. Le produit final est une image (ou des données) qui peut être interprétée plus facilement que l'original. Il ne faut pas confondre les systèmes d'analyse d'image avec les simples dispositifs d'affichage de la microscopie vidéo. Bien que ces derniers aient été utilisés fructueusement dans des études nécessitant des mesures précises d'otolithes (Methot et Kramer 1979; Bolz et Lough 1983), ils ne se prêtent ni à l'accentuation ni à la manipulation d'images.

Les progrès récents de la technologie ont permis de mettre les systèmes d'analyse d'image pilotés par micro-ordinateur à la portée de la bourse des chercheurs. Les systèmes courants se composent maintenant d'une caméra vidéo, d'une carte de numérisation montée dans un micro-ordinateur et d'un moniteur (voir par exemple Campana 1987). Pour la recherche sur les otolithes, la caméra vidéo est montée sur un microscope. La plupart des cartes de numérisation actuelles sont des cartes d'acquisition d'image, pouvant numériser et mémoriser 30 images par seconde. Ainsi, la visualisation et la manipulation des images en temps réel ne sont pas seulement possibles, elles sont la norme.

Tous les systèmes d'analyse d'image reposent sur la conversion d'une image en matrice de nombres; autrement dit, l'image est numérisée. Chaque position de la matrice représente un pixel (carré de quadrillage) dans l'image et chaque valeur numérique représente un niveau de gris (mesure de la luminosité) pour ce pixel. Par conséquent, toutes les opérations réalisables sur une matrice de nombres le sont aussi sur une image. Par exemple, on peut doubler le contraste de l'image en doublant le niveau de gris de chaque pixel. Étant donné que les résultats de la manipulation d'une matrice de nombres sont immédiatement visibles sur le moniteur, la manipulation d'images peut être aussi interactive et automatisée que souhaitée.

Dans le cadre des observations au microscope, les systèmes d'analyse d'image offrent trois grands avantages : l'accentuation, la manipulation et la quantification d'images. L'accentuation d'images est l'une des fonctions les plus importantes et les plus couramment utilisées. Des procédures simples permettent à l'utilisateur de soustraire une image d'arrière-plan de l'image entière, d'établir la moyenne de plusieurs images bruitées ou d'utiliser des filtres à basse ou haute fréquence pour ajouter ou enlever des détails. L'expansion de dynamique des niveaux de gris, qui permet de répartir les niveaux de gris dans une image peu contrastée sur l'ensemble des 128 niveaux (ou plus), peut révéler des détails complètement invisibles à l'œil nu (figure 2). Ces procédés d'accentuation d'image sont nettement plus efficaces que l'œil humain, bien incapable de distinguer 128 niveaux de gris.

Le principal avantage d'un système d'analyse d'image pour le dénombrement des accroissements est qu'il facilite leur interprétation visuelle. Au moment des mesures, divers autres avantages sont mis en évidence, le principal étant la facilité de mesure. Non seulement il est plus facile de régler la position d'une cible sur un moniteur vidéo qu'un micromètre oculaire, mais on peut mesurer des distances proches de la limite de résolution théorique de la microscopie optique (0,20 µm). De plus, toutes les mesures peuvent être enregistrées directement dans la mémoire de l'ordinateur, ce qui élimine la possibilité d'erreurs introduites par une transcription manuelle. Ces applications et de nombreuses autres sont décrites en détail ailleurs (Gonzalez et Wintz 1977; Hall 1979; Ballard et Brown 1982; Campana 1987).

Malgré les avantages indéniables des systèmes d'analyse d'image pour l'examen des microstructures d'otolithes, il est important d'en reconnaître les limites. Ces systèmes n'améliorent pas la résolution. Bien que le contraste visuel puisse être considérablement amélioré, la limite de résolution de la microscopie optique est inchangeable. En deuxième lieu, les capacités de dénombrement automatique de nombreux systèmes ne se prêtent pas encore aux études des microstructures d'otolithes. Et, en dernier lieu, le stockage d'images nécessite actuellement trop de mémoire (256 K) pour que soient créées de grandes archives. Compte tenu de la rapidité à laquelle évolue la technologie d'analyse d'image, ces deux dernières contraintes pourraient bien s'évaporer dans un avenir proche.

Interprétation des accroissements

FIG. 3. Séquence d'accroissements caractérisée par des accroissements journaliers (D) et subjournaliers (S), ainsi que des discontinuités (C). La séquence est unie et régulière en apparence; les changements de largeur et de contraste des accroissements sont souvent progressifs.

Une préparation type d'otolithe révèle de nombreuses structures annulaires, dont seules certaines sont des accroissements journaliers. Avec l'expérience, il devient généralement très facile de distinguer les « vrais » accroissements journaliers des autres marques. Néanmoins, les lecteurs d'otolithes inexpérimentés peuvent faire de graves erreurs en comptant les accroissements, et il arrive que des lecteurs chevronnés divergent (parfois de façon marquée) dans leur interprétation d'une séquence d'accroissements donnée. Cette part de subjectivité est l'une des plus importantes sources d'erreur dans l'examen des microstructures d'otolithes et explique en grande partie pourquoi des compteurs automatiques n'ont pas encore été mis au point. Cela explique aussi pourquoi la validation de l'âge (discutée dans Geffen, dans la publication citée en haut de la page) est plus importante comme moyen de vérifier l'habileté à interpréter les accroissements que comme moyen de vérifier la fréquence réelle de leur formation. Sont présentées dans cette section un éventail de lignes directrices qui permettront d'interpréter les caractéristiques microstructurales en connaissance de cause. Comme on peut s'y attendre, plus le lecteur est expérimenté et mieux l'échantillon est préparé, plus l'interprétation est facile.

Les trois marques observées au microscope optique le plus souvent confondues avec les accroissements journaliers sont, par ordre d'importance, les accroissements subjournaliers, les artéfacts et les discontinuités. Toutes, sauf les artéfacts, prêtent aussi à confusion dans l'interprétation des échantillons observés au microscope électronique à balayage (MEB). Les critères permettant de distinguer ces trois marques reposent en grande partie sur leur aspect visuel, en particulier le contraste et la largeur relative (figure 3). Par ailleurs, leur emplacement sur l'otolithe permet aussi de les identifier. Par exemple, les accroissements journaliers dans la région autour de la discontinuité d'éclosion sont souvent étroits, tandis que la croissance de la période juvénile est caractérisée par des accroissements larges et clairement définis. Au fur et à mesure que l'âge augmente, les accroissements ont tendance à devenir plus étroits, même infinitésimaux, ou encore discontinus. Des connaissances sur le régime de croissance général se révèlent souvent utiles pour interpréter une séquence d'accroissements (figure 4).

FIG. 4. Souvent, les accroissements journaliers se distinguent de structures semblables par leur emplacement sur l'otolithe et les caractéristiques de l'espèce étudiée. (À gauche). Les accroissements journaliers entourant la discontinuité d'éclosion (H) sur une sagitta d'aiglefin polie sont étroits et peu distincts pour les 10 à 20 premiers jours après l'éclosion, puis deviennent plus larges au stade postlarvaire et juvénile. De nombreux accroissements journaliers périnucléaires visibles à un grossissement plus élevé au microscope optique ne sont pas évidents dans cette photographie, qui ne montre que 24 des 39 accroissements chez une larve de 8,35 mm. Échelle = 10 µm. (À droite). À l'opposé de la sagitta de l'aiglefin, le lapillus d'une larve de doré jaune de 11 jours montre des accroissements journaliers larges presque depuis sa date d'éclosion. Des accroissements larges comme ceux-ci sont caractéristiques aussi des otolithes de nombreuses espèces de poissons tropicaux. Des grossissements faibles (300-500x) peuvent mieux convenir à l'examen de ce type d'espèces. Échelle = 20 µm.

Les accroissements journaliers et subjournaliers étant morphologiquement semblables, il est difficile de les distinguer. Les critères employés à cette fin s'appuient sur les facteurs différents qui ont contribué à leur formation. Les accroissements journaliers sont formés à une fréquence constante. La croissance de l'otolithe étant aussi de nature constante, ils se présentent donc souvent comme une séquence régulière de largeur et de contraste constants. En revanche, les accroissements subjournaliers peuvent se former à n'importe quelle date ou heure de la journée, ce qui entraîne une largeur moins régulière. La netteté à l'observation des accroissements subjournaliers est habituellement inférieure à celle des accroissements journaliers adjacents (figure 3), mais elle varie en fonction de l'importance du facteur masquant à l'origine de leur formation. En pratique, il est souvent préférable de trouver une région où les accroissements journaliers ne sont pas équivoques le long de l'axe de dénombrement choisi, puis de compter à partir de ce point vers l'extérieur (ou vers l'intérieur), en se fondant sur les critères de régularité et de continuité pour les interpréter. Lorsqu'un réglage de la mise au point semble « diviser » les accroissements, on peut souvent supposer que la plus large des deux structures est journalière. En effet, dans les cas où la croissance de l'otolithe a été rapide et que les accroissements subjournaliers sont nombreux, un examen légèrement hors foyer peut aider à éliminer les accroissements subjournaliers du champ de vision (figure 5). Cette méthode ne convient pas lorsque les accroissements sont étroits, comme autour de la discontinuité d'éclosion, étant donné que des groupes d'accroissements journaliers peuvent alors devenir évidents (figure 6). Si l'ambiguïté entre accroissements journaliers et accroissements subjournaliers subsiste, il est préférable d'éviter cette région de l'otolithe. Les axes de dénombrement ne doivent pas obligatoirement être linéaires, et la facilité d'interprétation d'une séquence donnée varie souvent entre les axes de dénombrement potentiels.

FIG. 5. Tactique pour régler le problème des accroissements subjournaliers et des accroissements divisés. (A) Vue correctement focalisée du bord d'une sagitta de hareng polie. Que ce soit dû à des problèmes de préparation ou à la présence d'accroissements subjournaliers, une séquence non ambiguë d'accroissements journaliers allant du noyau au bord passe soudainement à des accroissements « journaliers » (11 au moins) beaucoup plus étroits. Ce changement soudain de largeur des accroissements ainsi que la division apparente des accroissements les plus proches du centre de la zone marquée indiquent qu'elle doit être interprétée avec précaution. (B) Même vue qu'en (A), intentionnellement défocalisée. La périodicité du large patron sous-jacent dans la zone suspecte est semblable à celui de la séquence non ambiguë d'accroissements journaliers, ce qui suggère que la zone contient 4 ou 5 accroissements journaliers. (C) Autre région du bord de l'otolithe visible dans (A) et (B). Cette région de l'otolithe confirme l'interprétation des accroissements d'après l'examen défocalisé illustré en (B).

Les accroissements subjournaliers ont tendance à se manifester le plus souvent dans deux situations. Premièrement, dans les régions où l'otolithe a connu une croissance rapide, les accroissements journaliers sont très larges. Plus une zone de croissance est large, plus la possibilité de présence d'accroissements subjournaliers est grande et, surtout, plus il est facile de les voir. C'est une des raisons pour laquelle la microstructure de la sagitta d'un poisson juvénile peut être difficile à interpréter; en effet, ses accroissements ont tendance à être très larges (figure 7). Étant donné que le taux de croissance du lapillus est plus lent et plus uniforme sur le plan spatial, les accroissements sont plus étroits et donc mieux définis (figure 7) [pour en savoir plus, voir Secor et al. dans la publication citée en haut de la page]. Évidemment, cette différence de croissance des otolithes peut être contre-productive dans le cas des lapilli de vieux poissons, étant donné que les accroissements peuvent être étroits au point d'être difficilement distinguables.

FIG. 6. Parfois, les groupes d'accroissements journaliers semblent plus convaincants que de véritables accroissements journaliers. Les quatre accroissements surnuméraires (« faux ») indiqués sur cette photographie d'une sagitta de larve de hareng d'âge connu correspondent en réalité à une période d'environ 20 jours. Certains accroissements journaliers véritables sont visibles en haut à droite de la discontinuité d'éclosion (H). Un réglage minutieux et fréquent de la mise au point est nécessaire pour une interprétation correcte de ce type de séquence d'accroissements. Par ailleurs, dans ce cas, il est utile de bien connaître l'ensemble du patron de croissance des otolithes de hareng. Échelle = 10 µm.

FIG. 7. Comparaison de la microstructure du lapillus et de la sagitta d'une morue de 20 mm. Les deux otolithes ont été polis, puis reproduits à la même échelle. Échelle = 20 µm. La séquence de croissance dans le lapillus (en haut) se compose d'accroissements bien définis et de même largeur, mais ils sont de plus en plus étroits et difficiles à interpréter chez des juvéniles plusâgés. À l'inverse, les accroissements journaliers dans la sagitta (en bas) sont plus étroits que ceux du lapillus pour les 5 à 15 premiers jours après l'éclosion (non visibles à ce grossissement), puis s'élargissent avec l'âge. Les accroissements vers le bord de la sagitta sont plus de trois fois plus larges que ceux correspondant aux mêmes âges dans le lapillus; la sagitta renferme aussi des accroissements subjournaliers et/ou divisés dans les 15 derniers jours. Les accroissements journaliers sont plus larges, mais indistincts, autour du primordium accessoire nouvellement formé (AP) dans le coin supérieur droit.

La deuxième situation favorisant la visibilité des accroissements subjournaliers est un artéfact dû à des problèmes de préparation de l'otolithe. Pour plusieurs raisons, un rodage excessif peut faire davantage ressortir les accroissements subjournaliers que les accroissements journaliers. En effet, les premiers peuvent paraître réguliers et bien définis dans les préparations qui ont subi un rodage excessif, ce qui rend l'interprétation de la séquence particulièrement périlleuse (figure 8). Savoir reconnaître les régions trop rodées est donc susceptible de réduire les erreurs de dénombrement.

Les artéfacts optiques prennent plusieurs formes, certains pouvant même ressembler à des accroissements journaliers. La réfraction de la lumière par le bord courbe de l'otolithe, et autour de celui-ci, peut fausser la largeur des accroissements et/ou le nombre d'accroissements visibles, ce qui complique leur interprétation. Toutefois, en général, les effets de bord modifient l'aspect de seulement quelques accroissements, ce qui permet de réaliser une interpolation au besoin. Les artéfacts produisant des « reflets » d'accroissements sont davantage visibles juste à l'extérieur du périmètre de l'otolithe, bien qu'elles puissent être aussi rattachées à des discontinuités ou à des accroissements saillants. Ils se différencient par l'aspect des structures adjacentes. Les artéfacts se présentent en effet comme des reflets exacts, parfois en plusieurs copies, des accroissements les plus proches, mais ils sont habituellement plus nettement définis que la structure réfléchie (figure 9). Un réglage de la mise au point permettra de réduire le nombre d'artéfacts, mais il est également susceptible d'influer sur l'interprétation des véritables accroissements journaliers et ne devrait donc pas être le seul critère déterminant.

FIG. 8. Un rodage excessif peut rendre les accroissements subjournaliers plus saillants qu'ils ne le seraient autrement. Les accroissements subjournaliers sont évidents et les accroissements journaliers indistincts le long des deux axes de croissance identifiés d'une sagitta trop poncée de flet étoilé ( Platichthys stellatus). Les accroissements journaliers sont indiqués en noir. On constate que le patron journalier est plus évident dans la partie mieux préparée, en bas à droite.

FIG. 9. Les lignes fines entre les accroissements journaliers identifiés dans cette photographie de la sagitta d'un flet étoilé ont d'abord été considérées comme des accroissements subjournaliers (Campana et Neilson 1982), mais le fait qu'elles soient visibles au microscope optique et invisibles au microscope électronique à balayage révèlent qu'elles sont en fait des artéfacts rattachés à des accroissements saillants et/ou des discontinuités. Échelle = 10 µm.

Les discontinuités n'ont jamais été correctement définies, en partie parce que leur formation dépend de nombreux agents différents (Pannella 1980; Campana 1983, 1984; Gauldie 1988). Leur interprétation est facile lorsqu'elles se manifestent comme des accroissements particulièrement saillants, peut-être en réponse à un stress de courte durée (Campana 1983). Cependant, les discontinuités liées au cycle lunaire (Campana 1984) ou à l'interruption de croissance d'un otolithe (Pannella 1980) peuvent facilement être confondues avec des fractures ou des fissures. De plus, ces discontinuités peuvent sembler se situer sur un plan focal différent de celui des accroissements voisins (figure 3). Il ne s'agit pas d'accroissements journaliers et elles ne doivent pas être comptées à ce titre, bien qu'elles puissent recouvrir de vrais accroissements. Lors du dénombrement, il faut éviter les régions de croissance interrompue de l'otolithe, parfois caractérisées par des accroissements confluents ou de plus en plus étroits. S'il est impossible de trouver une séquence complète ailleurs, l'otolithe doit être jeté. Il n'existe somme toute aucun moyen d'établir la durée de l'interruption de sa croissance. Il faut toutefois noter que les discontinuités qui recouvrent une séquence d'accroissements en apparence normale indiquent rarement une interruption de croissance de l'otolithe (p. ex., figure 3).

Bien que la présence de primordia accessoires puisse compliquer la mesure de la largeur des accroissements (comme il en sera question par la suite), elle a peu d'effets sur leur dénombrement. Les accroissements sont presque invariablement contigus dans l'ensemble des zones de croissance correspondant à différents points de nucléation (p. ex., figure 7B, 11).

FIG. 10. Axe de croissance curvilinéaire du lapillus d'un exocet juvénile, Paraexocoetus brachypterus. Aucune ligne droite, qui couperait une séquence complète d'accroissements à angle droit, ne peut être tracée du noyau (N) au bord de l'otolithe. Pourtant, toutes les méthodes normalisées de rétrocalcul de croissance supposent une trajectoire linéaire.

FIG. 11. Primordium central (C) et primordium accessoire (A) de la sagitta d'un flet étoilé. Les accroissements individuels sont contigus lorsqu'ils passent d'un champ de croissance primordial à un autre, mais leur largeur change fortement. Échelle = 20 µm.

Optimisation des dénombrements

Il est parfois étonnamment difficile de parvenir, pour un otolithe donné, à un seul dénombrement d'accroissements satisfaisant. La plupart des scientifiques peuvent en compter jusqu'à 100, voire plus, mais les problèmes d'interprétation, les variations dans la qualité des préparations le long de l'axe de dénombrement, les trajectoires de dénombrement non linéaires et les limites de l'œil viennent invariablement compliquer les dénombrements. Sont présentées ci-après quelques suggestions empiriques visant à amoindrir ces difficultés.

Nos yeux ont tendance à se promener involontairement lorsque nous comptons de longues séquences de structures répétitives très rapprochées, comme les accroissements. C'est pourquoi il est judicieux de se servir des caractéristiques distinctes des otolithes, comme les discontinuités, les rayures ou les accroissements saillants, comme points d'interruption ou de repère pour l'œil. L'idéal consiste à compter par paquets de 10 à 15 accroissements entre les points de repère, car cela permet au lecteur de balayer de l'œil la région suivante pour voir si elle pose des problèmes d'interprétation, sans perdre de vue le dernier accroissement dénombré. Les points de repère se révèlent également utiles au moment d'un changement latéral d'axe de dénombrement. Par ailleurs, un réglage constant de la mise au point pendant le balayage permet non seulement de mieux distinguer les accroissements journaliers des accroissements subjournaliers, mais aussi de compenser les variations dans le plan focal des accroissements.

La qualité des préparations est rarement uniforme le long de l'axe de dénombrement. Dans la plupart des cas, il est possible de faire un dénombrement complet, mais il se peut aussi que des fissures, un ponçage excessif ou insuffisant fassent disparaître de courtes sections de la séquence d'accroissements. Étant donné que les largeurs des accroissements journaliers tendent à être autocorrélées, une interpolation peut se justifier si le nombre d'accroissements interpolé est très petit par rapport au nombre total. Les estimations d'âge reposant sur une interpolation de 5 % sont probablement acceptables, quoique le pourcentage exact soit arbitraire. Des pourcentages aussi élevés que 20 % ont été signalés (Methot 1983), mais ne sont pas recommandés. Souvent, le calcul par interpolation convient pour le bord de l'otolithe, mais n'est pas adapté aux zones où la largeur des accroissements change (c.-à-d. autour du nucleus).

Au minimum, deux dénombrements complets (et plus de préférence) doivent être réalisés pour chaque otolithe. En général, le fait de recompter prend moins de temps qu'analyser les différentes interprétations. L'interprétation pouvant varier selon le point d'origine de l'axe de dénombrement, il est recommandé de commencer le premier dénombrement à partir du bord extérieur de l'otolithe et le second à la discontinuité d'éclosion (ou au premier accroissement identifié). Il n'existe pas de convention stricte en ce qui concerne l'inclusion de la discontinuité d'éclosion et du bord extérieur de l'otolithe dans le nombre d'accroissements. La méthode adoptée doit donc toujours être indiquée. L'établissement d'un nombre d'accroissements considéré comme le meilleur pour un otolithe donné est traité ailleurs (Campana et Jones, dans la publication citée en haut de la page).

Mesure des accroissements

Il est foncièrement plus difficile de mesurer précisément la largeur des accroissements journaliers que de les dénombrer. En outre, l'interprétation de ces mesures en matière de croissance des otolithes ou des poissons n'est pas forcément simple (voir Campana et Jones, dans la publication citée en haut de la page). Sont présentées ci-après des recommandations concernant le choix d'un axe de mesure et de la collecte de données de mesure précises. Les indications concernant l'optimisation et l'interprétation d'images restent inchangées et ne seront pas redonnées dans la section qui suit.

Choix de l'axe de mesure

Les critères de longueur de l'axe et de netteté des accroissements régissant le dénombrement de ceux-ci s'appliquent aussi au choix d'un axe de mesure adéquat. Deux autres contraintes viennent s'y ajouter : l'axe de mesure doit être linéaire et la croissance des otolithes plus ou moins symétrique. Ces contraintes s'expliquent par l'utilisation consécutive des largeurs des accroissements dans le calcul du taux de croissance des otolithes ou des poissons. Pour être interprétées, les largeurs des accroissements doivent être considérées dans le contexte global de la taille de l'otolithe et/ou du taux de croissance. Pourtant, presque tous les otolithes ont un nucleus excentré, ce qui laisse supposer que l'on peut s'attendre à ce que la largeur d'un accroissement donné change avec la longueur et l'orientation du radius de l'otolithe examiné. On doit donc utiliser un seul axe linéaire pour mesurer la largeur des accroissements dans un otolithe donné. Pour mesurer la largeur des accroissements de plusieurs otolithes, l'orientation de l'axe de mesure doit être normalisée de sorte à réduire au maximum la variation entre poissons. Ces exigences sont de loin plus contraignantes que celles relatives au dénombrement des accroissements, car les régions difficiles à interpréter ou incorrectement préparées ne peuvent pas être évitées par un déplacement latéral du champ de vision. Ce n'est pas la seule complication. Quand l'axe de croissance de l'otolithe est curvilinéaire, il est impossible de mesurer la largeur maximale des accroissements (parallèle à l'axe de croissance) tout en conservant la linéarité entre le nucleus et le bord de l'otolithe (figure 10). Étant donné que les mesures obliques de la largeur des accroissements sont sans intérêt, les rétrocalculs de croissance de ce type d'otolithe devront reposer sur la longueur de l'axe de croissance curvilinéaire. Bien qu'il soit théoriquement possible de mesurer des axes de croissance curvilinéaires, cela a rarement été fait, probablement en raison de la difficulté à définir une ligne incurvée qui coupe tous les accroissements à angle droit.

La deuxième contrainte, soit la symétrie de la croissance, a trait aux axes de mesure traversant des régions où l'axe ou le taux de croissance a changé. Par exemple, la largeur d'un accroissement donné peut changer considérablement près d'un primordium accessoire (figure 11). Alors que les primordia accessoires sont couramment observés dans les sagittae, il est rare d'en observer dans les lapilli. C'est pourquoi il est préférable de choisir ces derniers pour mesurer la largeur des accroissements. Il arrive cependant que les axes de croissance changent sans présence de primordia accessoires. Par exemple, de nombreux otolithes sont presque ronds chez les larves de poisson, puis sont de plus en plus asymétriques lorsqu'elles se transforment en juvéniles. Ainsi, ce qui peut être un axe de mesure parfaitement adapté chez une larve peut ne pas convenir du tout chez un juvénile. On peut limiter cet effet en s'assurant que l'axe de mesure choisi pour les juvéniles est identique à celui utilisé pour les larves. Étant donné que les deux axes ne correspondront pas forcément à l'axe le plus long de l'otolithe (à l'un ou l'autre de ces stades du cycle biologique), on doit veiller à ce que les axes appropriés soient utilisés. La présence courante d'otolithes asymétriques indique en outre que la largeur des accroissements en elle-même (sans la relation poisson-otolithe) est un mauvais indicateur du taux de croissance.

Optimisation des mesures

La largeur des accroissements peut être mesurée sur des micrographies prises au microscope à balayage électronique, des micrographies prises au microscope optique, des images numérisées, des images vidéo affichées sur un écran, ou encore à l'aide d'un microscope optique muni d'un micromètre oculaire. Quelle que soit la méthode, la mesure de chaque accroissement doit être réalisée parallèlement à son axe de croissance, et non pas seulement parallèlement à l'ensemble de l'axe de croissance. Toutes les techniques comportent des sources potentielles de biais ou de difficultés de préparation, mais certains problèmes sont plus graves que d'autres. Le choix de la procédure de mesure doit donc dépendre des besoins d'exactitude et de précision ainsi que des possibilités d'accès à du matériel spécialisé.

La procédure exacte de mesure de chaque accroissement est probablement moins importante que l'uniformité de son application à tous les accroissements. En effet, il y a peu de raisons de croire que la mesure d'un accroissement à partir du bord médian d'une zone discontinue jusqu'au bord médian de la zone discontinue suivante sera plus (ou moins) précise que, disons, du centre d'un accroissement jusqu'au centre du suivant. Dans tous les cas, quel que soit le protocole suivi, il est très important de le suivre à la lettre pour tous les accroissements étudiés.

L'effet du plan focal sur le grossissement de l'image et la largeur des accroissements en résultant sont la principale source de biais dans la mesure de la largeur des accroissements. En microscopie optique, il est essentiel de mettre au point le plan focal pour obtenir une image sans distorsion de la séquence des accroissements. Cependant, la mise au point entraîne des changements dans la largeur et la position apparentes de chaque accroissement. On obtiendra une précision maximale par un choix de foyer optimal pour l'accroissement mesuré. Or, le plan focal optimal d'un accroissement n'est pas nécessairement identique à celui de l'accroissement adjacent et il en résulte un déplacement de la position des accroissements qu'il faut compenser à chaque mise au point. Il est toutefois plus difficile de compenser les changements causés par le grossissement. Ce problème se pose autant en microscopie optique qu'en microscopie visuelle. À ce jour, la meilleure solution proposée est d'atténuer le problème ou de l'éviter; l'otolithe doit être monté de sorte que le plan de l'accroissement soit aussi horizontal que possible. Il est peu probable que de faibles changements du foyer modifient considérablement la largeur apparente des accroissements. Toutefois, le déplacement latéral apparent de la position des accroissements peut être plus marqué et causer des erreurs de mesure importantes si le nouveau point de départ de la mesure n'est pas pris en compte après le changement de mise au point.

Un système d'analyse d'image (Campana 1987) ou un système de microscopie vidéo (Methot et Kramer 1979; Bolz et Lough 1983) sont les mieux indiqués pour mesurer la largeur des accroissements observés au microscope optique. Le premier présente l'avantage de permettre l'accentuation d'images, mais les deux offrent au lecteur d'otolithes une image témoin sur un grand écran vidéo, ainsi que la possibilité de régler continuellement le plan focal. Les mesures ainsi obtenues sont beaucoup plus précises qu'avec un micromètre optique. Les données étant transmises directement à un fichier informatique, les possibilités d'erreur sont nettement moindres. Il est en outre beaucoup plus rapide de faire des mesures sur une image vidéo qu'à l'aide d'un micromètre oculaire ou sur des photographies.

Les micrographies prises au microscope à balayage électronique donnent les mesures les plus précises de la largeur des accroissements. Elles ne sont pas exposées aux effets de la réfraction qui peuvent déplacer ou déformer une image en microscopie optique. Seuls le matériel employé pour numériser les accroissements et la clarté de la photographie limitent alors l'exactitude et la précision. Outre son accessibilité, la principale contrainte de la mesure de la largeur des accroissements sur ce type de micrographies est la gravure de l'échantillon. Il est en effet parfois difficile de graver une séquence complète d'accroissements (Blacker 1975; Campana et Neilson 1985). C'est pourquoi le microscope à balayage électronique convient mieux à la mesure d'accroissements dans des régions discrètes de l'otolithe que le long de radii complets.