Méthodes de détermination de l’âge à l’aide des annuli des otolithes

Préparation de coupes fines

Les coupes fines sont souvent le meilleur outil d’étude des annuli d’otolithe. Elles peuvent également servir à examiner les accroissements journaliers de gros otolithes. Elles sont normalement obtenues au moyen de coupes transversales au niveau du noyau des otolithes.

La méthode décrite ici permet d’enrober et de réaliser des coupes d’otolithes d’une longueur supérieure à 3 mm pour la préparation de lames d’otolithes individuels. Ces coupes sont effectuées à l’aide d’une scie Isomet.

Enrobage

Il est possible de couper les très gros otolithes (plus de 2 cm de longueur) à l’aide d’une scie Isomet sans les enrober au préalable. Il est également possible d’enrober les gros otolithes (plus de 1 cm de longueur) dans de la paraffine liquide avant de pratiquer les coupes. Cependant, pour que la coupe soit précise, il est préférable d’enrober les otolithes dans de la résine époxyde durcie. La plupart des résines époxydes et composés solidifiants peuvent également convenir, à condition qu’elles soient transparentes et produisent un enrobage très dur.

Pour préparer la résine époxyde :

• placez-la avec le durcisseur dans un gobelet en papier sur le plateau d’une balance après avoir taré le récipient
  • n’utilisez pas de gobelet en plastique
• mélangez pendant au moins 3 ou 4 minutes
• soumettez le contenu à des ultrasons pendant 5 minutes jusqu’à suppression des bulles ou jusqu’à ce que le mélange soit limpide
  • une certaine quantité d’écume restera à la surface
• si vous n’avez que quelques otolithes à enrober, laissez reposer la résine époxyde de 5 à 15 minutes

Il faut de 45 à 60 minutes à la résine époxyde et au durcisseur pour se solidifier, ce qui suffit à l’enrobage d’environ 20 otolithes.

Procédure sans moulage

• versez quelques millilitres de résine époxyde en forme de poire (environ 2 cm de longueur et 1 à 2 cm de largeur) sur une feuille de Parafilm
• collez une petite étiquette en papier sur l’extrémité la plus étroite de la quantité de résine
• préparez un autre bain de résine époxyde de préparation que vous utiliserez pour tous les otolithes
• plongez ensuite l’otolithe dans la résine époxyde, sulcus vers le haut
  • utilisez une sonde fine pour éliminer les bulles autour de l’otolithe, particulièrement à l’intérieur et à proximité du sulcus
• à l’aide d’une pince, retirez l’otolithe de la résine époxyde de préparation et déposez-le, sulcus vers le bas, dans le bain de résine époxyde d’enrobage
  • l’axe long de l’otolithe doit être placé parallèlement à l’axe long de la goutte de résine
• poussez ensuite l’otolithe jusqu’au fond en prenant soin de ne pas créer de bulle

Laissez la résine solidifier pendant la nuit, puis nettoyez la base du bloc de résine époxyde avec de l’éthanol à 95 %. Déposez quelques millilitres de résine époxyde nouvellement mélangée sur la base du bloc pour enrober complètement l’otolithe. Laissez la résine reposer 3 jours avant de procéder à la coupe de l’otolithe. Nettoyez les traces de résine époxyde liquide renversée à l’éthanol à 95 %.

Procédure de moulage

Nous utilisons des moules à 12 puits, mesurant 19 cm x 11 cm, en EPDM (mélange de silicone et de caoutchouc synthétique). Chaque puits mesure 4 cm x 2 cm x 0,5 cm et peut contenir jusqu’à 4 ml de résine époxyde.

La préparation des moules consiste à appliquer à l’aide d’un petit pinceau une mince couche d’agent de démoulage, comme le Frekote (Henkel/Loctite). Il faut ensuite laisser sécher. Il est recommandé d’appliquer l’agent de démoulage immédiatement après la dernière utilisation du moule.

Préparez les étiquettes et couvrez les otolithes de résine époxyde comme dans le cas de la procédure sans moulage. Laissez ensuite la résine durcir toute la nuit avant de retirer l’otolithe enrobé. Ne l’essuyez pas avec un tampon imbibé d’éthanol. Il est généralement inutile d’appliquer une couche supplémentaire de résine époxyde sur les otolithes. Laissez le bloc sécher 3 jours avant de réaliser la coupe.

Coupe

Nous utilisons une scie Isomet à lame diamantée à vitesse lente. Toute autre scie semblable peut également être utilisée. Il est possible de préparer une coupe fine d’otolithe enrobé de résine époxyde en une seule étape d’environ 2 minutes si la scie est équipée de 2 lames séparées par un espace.

Fixez le bloc de résine époxyde perpendiculairement à la lame au moyen d’une bride de serrage à encoche en V de manière à ce que l’otolithe soit placé dans la partie inférieure du bloc. Remplissez le bac à eau de la scie d’une solution d’eau et de glycérine à 60 % en quantité suffisante pour que la lame se contente d’effleurer la surface du mélange. Nous utilisons des lames de 10,16 cm placées entre des brides de 7,62 cm. En n’exposant que 1,27 cm de la lame, l’oscillation en est réduite au minimum.

Si vous utilisez 2 lames, utilisez un mince espaceur en métal ou en plastique d’un diamètre de 7,62 cm et d’une épaisseur convenant à la coupe à effectuer pour les séparer. Habituellement, vous utiliserez un espacement de 500 µm, qui permet de préparer une coupe de 400 à 500 µm d’épaisseur.

La vitesse de rotation de la scie peut être relativement élevée (même si elle reste lente), avec un poids de 100g sur la partie supérieure, jusqu’à ce que la lame ait presque traversé complètement la résine époxyde. Arrêtez immédiatement la scie après la chute d’un des côtés du bloc de résine. Retirez le bloc de la bride de serrage et détachez la coupe du bloc à l’aide des doigts ou d’une pince (elle est probablement déjà presque entièrement détachée). Rincez la coupe dans de l’éthanol à 95 %, puis coupez le point d’attache du bloc brisé à l’aide d’un scalpel.

Polissage

Polissez une des faces de la coupe à l’aide d’une pellicule abrasive sèche de 30 µm fixée sur une surface lisse (comme une plaque de verre), puis à l’aide d’une pellicule de 3 µm moulée sur un doigt.

Le polissage est effectué rapidement et devrait servir uniquement à enlever les rayures profondes. Dans de nombreux cas, il est inutile.

Montage

Vous pouvez ensuite monter la coupe sur une lame pour l’analyser au microscope. Nous utilisons souvent de la colle cyanocrylate ou un adhésif thermoplastique.

Il est cependant possible d’obtenir une fixation plus durable avec de la résine époxyde. Pour ce faire, il faut suivre une démarche semblable à la méthode de préparation d’un frottis sanguin. Au moyen d’une lame de microscope, appliquez une couche de résine époxyde sur une moitié de la lame utilisée. La couche de résine époxyde ne doit pas être plus épaisse que la coupe (environ 400 µm d’épaisseur).

Glissez la coupe dans la résine époxyde en vous assurant qu’aucune bulle ne se forme dessous et qu’il n’y a pas de résine dessus. Enfoncez la coupe dans la résine, puis mettez la lame à sécher 2 à 3 jours. Polissez la surface de la coupe au besoin.

Détermination de l'âge en série

La détermination de l’âge est une étape importante de l’évaluation des stocks de poissons. Chaque année dans notre laboratoire, nous déterminons l’âge de dizaines de milliers d’otolithes au moyen de coupes transversales dans le cadre d’évaluations de stocks.

Notre méthode de préparation comprend :

• l’enrobage de 50 à 100 otolithes dans de la résine de polyester
• la coupe de ceux-ci avec une scie à haute vitesse pour obtenir des coupes transversales minces
• l’application d’un enduit transparent à ces coupes pour améliorer la visibilité des marques
• la détermination de l’âge des otolithes à l’aide d’un système d’analyse d’images

Grâce à cette méthode, une personne peut quotidiennement préparer de 300 à 800 otolithes ou déterminer l’âge d’environ 200 otolithes.

Il faut cependant souligner que cette méthode convient davantage aux otolithes solides d’au moins 1 cm de longueur. Pour les otolithes plus petits ou plus fragiles, il est préférable d’avoir recours à un processus beaucoup plus long qui consiste à les enrober dans de l’époxyde et à les couper individuellement avec une scie Isomet.

Enrobage

Comme moules, nous utilisons des plateaux en aluminium dont les dimensions hors tout sont de 177 x 154 x 18 mm. Ils sont dotés :

• d’un fond et de parois rainurés (les rainures servent de guides pour la coupe)
• de parois amovibles qui facilitent le détachement du bloc de résine durcie
• de boulons amovibles qui permettent d’aménager des trous dans le bloc de résine, où seront insérées les tiges de positionnement de la scie

Appliquez une mince couche de cire à parquet en pâte à l’intérieur du plateau afin de l’étanchéifier. Cela facilitera le démoulage et préviendra les fuites de résine.

Pour que l’ordre des coupes soit respecté, placez un morceau de spaghetti sec en diagonale dans le plateau (du coin supérieur gauche au coin inférieur droit).

La résine doit toujours être utilisée sous une hotte et toute trace de ce produit doit être nettoyée à l’acétone.

Versez une couche de résine dans les plateaux de manière à couvrir le spaghetti et à remplir les coins. Une fois la résine durcie, vous pouvez graver des lignes de référence en vous servant des rainures du plateau comme guides. Disposez les otolithes de manière à ce que leur noyau soit au-dessus d’une ligne de référence. Sans modifier l’alignement des otolithes, remplissez les plateaux de résine. Mettez-les à durcir pendant au moins 24 heures avant d’effectuer les coupes.

Chaque plateau peut contenir de 100 à 150 otolithes (selon leur taille).

Coupe

Nous avons adapté une rectifieuse plane pour l’équiper d’un disque diamanté et la modifier en lui ajoutant :

• un plateau avec drain pour faciliter l’écoulement de l’eau
• un support de fixation et une base de coupe pour le bloc de résine
• une sortie d’eau pour refroidir et lubrifier la lame

Pour effectuer la coupe, nous :

• retirons les blocs (d’une épaisseur d’environ 10 mm) des moules
• installons les blocs sur les tiges de positionnement de la scie
• fixons les blocs au moyen du support de fixation

À l’aide des commandes de réglage vertical, horizontal et latéral, nous alignons l’extrémité d’un des guides de coupe du bloc sur l’axe de la lame.

Des coupes de 1 mm d’épaisseur sont réalisées, rincées à l’eau et séchées à l’air. Il est possible de préparer des coupes de 0,5 mm d’épaisseur sans cassure.

Il doit être possible d’identifier chaque otolithe ou paire d’otolithes tout au long des processus d’enrobage et de coupe. Un crayon gras peut servir à numéroter les otolithes sur les bandes de résine coupées, directement sous les otolithes.

Placez les lames de coupes d’otolithes et leurs étiquettes sur des plaques d’acrylique transparentes (185 x 95 x 2 mm) puis enduisez-les d’un revêtement transparent par atomisation. Une fois les plaques sèches, appliquez une couche de finition afin de protéger les coupes et de rehausser leur clarté. Le revêtement a tendance à cacher les rayures et les sillons des coupes d’otolithes.

Détermination de l’âge

Une fois les plaques sèches, l’âge des otolithes est déterminé à l’aide d’un système d’analyse d’images sous une lumière réfléchie et avec un grossissement de 10 à 12x.

Cette méthode de préparation des otolithes est un moyen efficace et économique de déterminer leur âge et d’entreposer un grand nombre d’échantillons. Puisque les plaques d’otolithes sont sèches, elles peuvent être entreposées avec un encombrement réduit (p. ex., à la verticale dans des classeurs) pendant une durée indéfinie.