Préparation des microstructures d’otolithes

Apprenez à préparer rapidement des microstructures d’otolithe à l’aide d’une colle cyanoacrylate ou d’une colle thermoplastique.

Sur cette page

• Aperçu
• Montage de l’otolithe
• Retourner un otolithe monté dans de la colle
• Polissage
• Exemples

Aperçu

La préparation des otolithes pour en examiner la microstructure nécessite de l’entraînement, et les premières tentatives peuvent être frustrantes. Cependant, il est possible d’obtenir de bons résultats de façon constante après quelques jours ou semaines d’entraînement, selon la taille de l’otolithe et la netteté de sa microstructure.

Le montage de l’otolithe sur une lame de microscope avec de la colle cyanoacrylate ou de la colle thermoplastique est une méthode de préparation rapide. De cette façon, vous pouvez facilement retourner et polir une face ou les deux faces d’une coupe fine.

Cette méthode est idéale pour la plupart des otolithes de larves et de juvéniles. Pour les otolithes d’adultes, il est souvent préférable de préparer d’abord une coupe fine, puis de la polir. Vous pouvez aussi utiliser la méthode de David Secor pour la préparation de coupes fines incluses dans de la résine époxyde pour les microstructures. Cette méthode demande beaucoup de temps, mais donne de bons résultats pour les otolithes volumineux.

Montage de l’otolithe

Pour la plupart des otolithes de plus de 50 à 100 µm de diamètre, vous devrez les polir afin qu’apparaissent complètement les accroissements minces qui encerclent le noyau. Si c’est le cas, l’otolithe devra être monté de telle sorte que le plan des accroissements soit parallèle à la lame du microscope.

Pour certains otolithes, cela signifie que la face du sulcus doit être orientée vers le haut sur la lame de manière à ce que l’otolithe repose à plat. Toutefois, tant que l’otolithe repose à plat, la face vers le haut importe peu. Dans certains cas, il est préférable de placer vers le haut la face de l’otolithe qui présente la plus grande épaisseur entre le noyau et la surface. Vous éliminerez ainsi  cette matière excédentaire par polissage.

La colle au cyanoacrylate est très efficace pour fixer l’otolithe à la lame, tout en éclaircissant partiellement l’otolithe. Cette colle s’applique facilement et rapidement et l’otolithe peut être retourné après le polissage. Cependant, elle a tendance à se détacher de la lame après un an ou plus d’entreposage, surtout après avoir été exposée à l’huile d’immersion. Pour la plupart des études, ce n’est pas un problème, puisque l’otolithe est habituellement examiné dans un délai relativement court. Cependant, si on doit conserver les otolithes pendant de longues périodes, il ne faut pas utiliser cette colle.

Comment monter un otolithe avec de la colle

Pour monter l’otolithe dans de la colle :

1. placez l’otolithe près du centre de la lame de microscope
   • montez seulement un otolithe par lame
2. placez la lame sur la platine d’un microscope de dissection à faible grossissement
3. assurez-vous que l’otolithe repose à plat
4. déposez une goutte de colle tout près de l’otolithe, mais sans qu’elle le touche
   • si l’applicateur de colle touche l’otolithe, ce dernier y restera probablement collé
5. utilisez le microscope pour examiner la goutte de colle et l’otolithe, puis trempez le bout d’une sonde dans la goutte de colle à un angle incliné et amenez la colle autour et sur le dessus de l’otolithe
   • la tension de surface permet à la colle de se déplacer avec la sonde (tant que la sonde est maintenue à un angle d’environ 30 degrés par rapport à la lame) sans que la sonde touche la lame
   • il est préférable que la sonde ne touche pas l’otolithe pour qu’il ne s’y colle pas

Il est important de ramener de la colle sur l’otolithe de façon à ce qu’il en soit entièrement recouvert. Une fois l’otolithe recouvert, l’excès de colle peut être étendu sur d’autres parties de la lame. Cependant, il y a un avantage à laisser l’otolithe dans un petit dôme de colle dont le sommet couvre le dessus de l’otolithe.

Ne touchez pas à la colle et à l’otolithe pendant le séchage, qui prend de 15 minutes à 2 heures. La colle est sèche lorsque la pointe d’une sonde y laisse une marque évidente.

Colle thermoplastique

Il est également possible d’utiliser de la colle thermoplastique pour le montage. Cette colle fixe efficacement l’otolithe à la lame et peut être chauffée pour enlever ou retourner l’otolithe. Toutefois, elle rend le polissage un peu plus salissant. C’est le meilleur choix pour les otolithes volumineux, mais en revanche, cette colle est plus difficile à utiliser pour les petits otolithes ou les coupes fines qui doivent être retournées.

Pour monter un otolithe avec de la colle thermoplastique :

1. chauffez la lame de microscope à environ 275 degrés Celsius sur une plaque chauffante
2. ajoutez une légère touche de colle à la lame chaude
3. placez l’otolithe dans le résidu liquide gommant de la colle
   • il n’est pas nécessaire de recouvrir l’otolithe avec la colle, comme il faut le faire avec l’autre type de colle
   • la colle ne sert qu’à fixer le dessous de l’otolithe à la lame
4. ajustez l’orientation de l’otolithe pendant que la lame est encore chaude

La colle durcit rapidement lorsque l’on enlève la lame de la plaque chauffante. Pour déplacer l’otolithe ou l’enlever de la lame, il suffit de la chauffer jusqu’à liquéfaction de la colle.

Retourner un otolithe monté dans de la colle

Il est relativement facile de retourner un otolithe monté dans de la colle si vous avez besoin de polir les 2 faces pour en faire une coupe fine. La coupe fine obtenue est généralement d’excellente qualité. Elle est suffisamment mince pour permettre une bonne transmission de la lumière et donc un examen limpide de la séquence d’accroissements journaliers.

Lorsque vous polissez la première face de l’otolithe, arrêtez juste avant d’atteindre le plan des accroissements. Pour retourner l’otolithe :

1. trempez la lame de microscope (à laquelle est fixé l’otolithe) dans de l’eau pendant environ 10 minutes
2. sortez la lame de l’eau et placez-la sur la platine d’un microscope à dissection sous une lumière réfléchie
   • séchez rapidement la partie inférieure de la lame avec un essuie-tout, mais pas la surface supérieure à laquelle est fixé l’otolithe qui doit rester mouillé
3. à l’aide d’un scalpel, découpez un carré dans la colle autour de l’otolithe
4. laissez l’équivalent du diamètre de l’otolithe de chaque côté de ce dernier
5. maniez le scalpel avec un mouvement de balancement
   • en observant la coupe au microscope, vous verrez la colle se soulever de la lame

Habituellement, le carré de colle contenant l’otolithe se détache complètement de la lame lors de la dernière coupe (quatrième côté). Si ce n’est pas le cas, n’utilisez pas le scalpel pour tenter de couper sous l’otolithe, car cela cassera l’otolithe presque immanquablement.

Refaites plutôt 4 nouvelles coupes au scalpel un peu plus près de l’otolithe. Si l’otolithe et le carré de colle ne se détachent toujours pas de la lame, essayez de faire tremper la lame dans de l’eau pendant encore 10 minutes et répétez la procédure.

Séchage et retournement de l’otolithe enlevé

Enlevez le carré de colle contenant l’otolithe, et utilisez une sonde pour pousser le carré au bord de la lame. Laissez le carré dépasser le bord à moitié pour accélérer le séchage.

Pour recoller l’otolithe sur la même lame, vous pouvez gratter le reste de colle avec les doigts, puis sécher la lame avec un chiffon.

Laissez sécher la lame et la colle pendant 5 à 10 minutes sous la lumière du microscope.

Une fois sec, utilisez une pince pour retourner le carré de colle et laissez-le sécher encore 5 minutes. À ce stade, vous pouvez replacer le carré au centre de la lame en vue de le recoller.

Recollage

Le recollage de l’otolithe retourné est plus simple que la procédure de collage d’origine :

• déposez une goutte de colle immédiatement à côté du carré de colle contenant l’otolithe, mais sans qu’elle le touche
• à l’aide d’une sonde, étendez la colle autour du carré sur tous les côtés
  • la tension de surface attirera la colle sous l’otolithe
• il est inutile d’étendre de la colle sur le dessus du carré, puisqu’il faudra le polir plus tard de toute façon

Une fois que la colle est sèche (au bout d’environ 1 heure), vous pouvez polir la préparation en arrêtant juste avant d’atteindre le plan des accroissements.

Retournement des otolithes montés avec de la colle

L’avantage d’utiliser de la colle est que le carré contenant l’otolithe garde l’otolithe rigide. L’otolithe retourné se trouve ainsi exactement à l’opposé du plan de polissage d’origine, ce qui facilite grandement la préparation d’une coupe fine et uniforme.

Ce n’est pas le cas avec la colle thermoplastique qui, une fois réchauffée, permet de retourner l’otolithe, mais peut rendre difficile la mise à plat de l’otolithe retourné sur la lame.

Polissage

Vous devrez polir la plupart des otolithes de plus de 50 à 100 micromètres de diamètre pour enlever la matière excédentaire et révéler tous les accroissements minces qui entourent le noyau.

On croit souvent à tort que si les accroissements journaliers sont clairement visibles en un endroit de l’otolithe, le polissage n’est pas nécessaire. Toutefois, la partie centrale de l’otolithe est la plus épaisse et la plus susceptible de masquer tout accroissement près du noyau. Par conséquent, des accroissements clairement visibles ailleurs dans l’otolithe ne signifient pas nécessairement que toute la séquence de croissance est visible.

Seule la comparaison des accroissements visibles avant et après le polissage indique s’il faut polir ou non les otolithes d’une espèce et d’une taille données.

Utilisation d’une pellicule de rodage métallurgique

Il est possible de polir un otolithe monté sur une lame de microscope avec de la colle liquide ou thermoplastique. Fixez la pellicule de rodage métallurgique à endos adhésif sur une plaque de verre sans rayures ou toute autre surface très lisse.

Il est important que la surface soit lisse, car des aspérités ou des rayures peuvent ébrécher l’otolithe pendant le polissage. Pour de nombreux otolithes, 2 pellicules abrasives de grains différents (30 µm et 3 µm) collées côte à côte suffisent. Les pellicules de rodage de ce type sont sèches et donc plus faciles à utiliser que les pellicules abrasives humides.

Processus de polissage

Pour polir l’otolithe :

1. posez la lame de microscope à l’envers sur la pellicule abrasive
2. centrez l’otolithe entre l’index et le majeur, en exerçant le moins de pression possible (pour éviter de le casser)
3. frottez la lame sur la pellicule avec un mouvement circulaire rapide

Le temps de polissage varie selon :

• l’épaisseur de l’otolithe
• le grain de la pellicule abrasive
• la quantité de colle recouvrant l’otolithe

Cependant, il est souvent préférable de commencer par quelques secondes de polissage avec une pellicule à grains fins, et de vérifier le niveau de polissage au microscope pour déterminer la quantité de matière enlevée.

Il est déconseillé de polir vigoureusement avant d’être à l’aise avec la vitesse de polissage, car on peut trop polir (et gâcher) un otolithe en moins de 10 secondes.

Une fois l’évaluation initiale réalisée, vous pouvez polir l’otolithe jusqu’à 10 secondes sur la pellicule à grain de 30 µm. Poursuivez de 2 à 10 secondes sur la pellicule à grain de 3 µm pour lisser la surface en préparation de l’examen au microscope.

Les petits otolithes ne peuvent être polis qu’avec la pellicule de 3 µm. En passant rapidement le doigt sur l’otolithe, vous enlèverez les débris de surface avant d’évaluer le polissage sous un microscope composé.

Répétez le polissage et l’examen de l’otolithe au microscope jusqu’à ce que le plan de polissage soit tout juste au-dessus du plan des accroissements. L’otolithe est alors prêt pour ces opérations :

• mesure
• interprétation
• dénombrement

Si l’otolithe est particulièrement volumineux, vous devrez peut-être le retourner afin d’en polir l’autre face. Ce double polissage consiste essentiellement en la préparation d’une coupe fine. Si un double polissage est nécessaire, arrêtez de polir la première face un peu avant d’atteindre le plan des accroissements. Autrement, ils deviendront moins nets si l’on enlève trop de matière.

Plan de polissage et plan des accroissements

L’étape cruciale du polissage d’un otolithe consiste à vérifier la position du plan de polissage par rapport au plan des accroissements. Dans un premier temps, vous devez le faire sous un microscope composé à faible grossissement (environ 100x pour tous les otolithes sauf les plus gros).

On fait d’abord la mise au point sur la surface de polissage de la colle. Cette surface est facilement reconnaissable par la présence de rayures de surface et de débris. Un polissage d’une seconde sur une pellicule abrasive à grain de 3 µm aide à rendre plus nette la surface sur les otolithes non polis au préalable.

Aux étapes ultérieures du polissage, la surface de polissage se trouve à l’intérieur de l’otolithe plutôt qu’à la surface de la colle.

Une fois que vous avez localisé la surface de polissage, recadrez le microscope sur le plan des accroissements ou primordia. Ce plan est localisé lorsque les accroissements ou primordia sont dans la meilleure mise au point possible.

Aux premières étapes du polissage, ce plan est peu visible (ou parfois pas du tout visible). Il reste en effet une bonne épaisseur de colle et de matière d’otolithe entre la surface et le plan des accroissements.

Cela seul indique qu’un polissage beaucoup plus important est nécessaire. En général, la mise au point nécessaire pour passer du plan de polissage au plan des accroissements indique la quantité de polissage encore requise.

Achèvement du polissage

À mesure que vous répétez la séquence polissage et examen par microscope, la distance entre la surface de polissage et le plan des accroissements rapetisse.

Finalement, les accroissements deviennent visibles à la mise au point du microscope sur la surface. Cela indique que le polissage est presque terminé. C’est également le moment où vous pouvez augmenter le grossissement à environ 400x pour peaufiner le polissage. À ce stade, vous ne devez utiliser que la pellicule abrasive à grain fin (3 µm). Le polissage se termine habituellement lorsque les accroissements sont visibles avec la mise au point faite sur le plan de polissage, à un grossissement de 400x. En d’autres termes, on arrête le polissage juste avant d’atteindre le plan des accroissements. Cet examen microscopique doit être réalisé sur la partie de l’otolithe où l’on comptera les accroissements.

La procédure de polissage vise à rendre la séquence d’accroissements nettement visible sur un axe donné entre le noyau et le bord. Comme la plupart des otolithes ne sont pas complètement planes, le polissage peut être optimal pour 1 axe de croissance alors qu’il est insuffisant ou excessif pour d’autres. Cela ne pose pas de problème tant que l’axe de croissance retenu contient la séquence complète d’accroissements.

Le temps nécessaire au polissage complet d’une face d’otolithe varie selon la taille de l’otolithe et l’habileté du polisseur. Habituellement, un polisseur expérimenté prend de 1 à 5 minutes pour polir un otolithe de 100 µm.

Exemples

Les paires d’images suivantes montrent une sagitta de truite collée à une lame de microscope à différentes étapes du processus de polissage. La clé pour le contrôle du polissage consiste à faire la mise au point d’abord sur la surface de polissage (images de gauche), puis sur le plan des accroissements (images de droite).

Vous savez qu’un otolithe a été correctement poli lorsque sa surface polie se trouve tout juste au-dessus du plan des accroissements. Bon nombre des accroissements seront visibles à la mise au point sur la surface de polissage. Par contre, ils ne doivent pas apparaître aussi nettement qu’à la mise au point sur les accroissements eux-mêmes.

Vous savez qu’un otolithe a été trop poli lorsque les accroissements ne sont pas visibles. Un polissage qui s’est poursuivi même légèrement au-delà du plan des accroissements les fait généralement complètement disparaître. Si les accroissements d’une certaine partie de l’otolithe ont été visibles presque tout au long du polissage, mais cessent de l’être vers la fin, il a probablement été trop poli. Cela peut arriver si le plan des accroissements n’est pas tout à fait parallèle sur le plan de la lame de microscope. Cela fait disparaître certaines parties en raison du surpolissage avant que d’autres parties soient prêtes. Cela ne pose pas de problème tant qu’une séquence complète d’accroissements est visible ailleurs sur l’otolithe.

Un otolithe poli jusqu’au plan des accroissements est plus difficile à interpréter qu’un otolithe sur lequel il reste une mince couche de matière non polie. Les accroissements subjournaliers et les divisions d’accroissements tendent à dominer dans les séquences de croissance polies jusqu’au plan des accroissements.